Caracterização funcional do gene codificador de proteína CD14 e do gene não codificador de proteína LINC01133 em linhagens celulares humanas de câncer de mama triplo negativo / Functional characterization of the CD14 protein-coding gene and the non-protein-coding LINC01133 gene in triple negative human breast cancer cell lines

Dentre os subtipos de câncer de mama, o triplo negativo (TNBC) é o que apresenta as maiores taxas de mortalidade, sendo, portanto, considerado um enorme desafio para a clínica. O uso de moléculas como marcadores tumorais vem auxiliando o clínico no diagnóstico, no prognóstico e, até mesmo, no tratamento do TNBC, sendo essenciais na redução de suas altas taxa de mortalidade. No entanto, um pequeno grupo de marcadores tumorais são validados na prática clínica, estimulando à busca por novos alvos, e sua caracterização funcional, como forma de se entender a Biologia desta doença. Assim, o objetivo deste trabalho é caracterizar funcionalmente o gene codificador de proteína CD14 e o gene não codificador de proteína LINC01133 em linhagens celulares humanas de TNBC, no intuito de descobrir o papel destas moléculas na progressão tumoral. Na primeira parte deste trabalho, analisou-se a expressão do CD14 frente à um painel de linhagens celulares que representam os diferentes subtipos dos tumores mamários. O CD14 exibiu elevados níveis de expressão nas linhagens nãotumorigênicas MCF10A e MCF12A e baixos níveis na linhagem triplo negativa Hs578T. A partir destes resultados, o CD14 foi superexpresso na linhagem Hs578T. Ensaios de caracterização funcional mostraram que a superexpressão do CD14 reduziu a capacidade migratória e invasiva das células, efeito que foi hipoteticamente relacionado ao aumento da expressão da E-caderina. No entanto, observou-se aumento no potencial tumorigênico, levando-nos a sugerir seu envolvimento num possível mecanismo utilizado pelas células para compensar a significativa redução do potencial migratório e invasivo. Os resultados obtidos indicam que o nível basal de expressão do CD14 observado na linhagem Hs578T é importante, podendo contribuir para a desenvolvimento primário do tumor, atuando como um oncogene. Na segunda parte deste trabalho, analisou-se a expressão de 10 RNAs longos não codificadores (lncRNAs), frente ao mesmo painel de linhagens descritoanteriormente. Dentre estes, o lncRNA LINC01133 exibiu baixos níveis de expressão nas linhagens não-tumorigênicas MCF10A e MCF12A e elevados níveis na linhagem triplo negativa Hs578T, sendo, então, escolhido como alvo de estudo. A partir destes resultados, decidimos superexpressar, de forma indutível, o LINC01133 na linhagem MCF10A e nocautear este gene, via sistema CRISPR/Cas9, na linhagem Hs578T. Ensaios de caracterização funcional mostraram que a superexpressão do LINC01133 na linhagem MCF10A reduziu a proliferação celular e inibiu o crescimento de colônias dependente de ancoragem, mas, em contrapartida, aumentou o crescimento de colônias independente de ancoragem e a capacidade migratória e invasiva destas células. No entanto, sugerimos que isto não seja suficiente para tornar estas células tumorigênicas e metastáticas. Por outro lado, o nocauteamento do LINC01133 na linhagem triplo negativa Hs578T aumentou de forma considerável todos os parâmetros de malignidade analisados. Baseado nos dados obtidos, sugerimos que o elevado nível de expressão do LINC01133 na linhagem Hs578T é importante na regulação negativa de processos relacionados com a progressão tumoral, atuando com um supressor tumoral. Os dados obtidos em nosso estudo contribuem para o enriquecimento de informações relacionadas à Biologia do TNBC, auxiliando, desta forma, no desenvolvimento de potenciais protocolos clínicos e terapêuticos utilizandos estes biomarcadores

Among the breast cancer subtypes, the triple negative (TNBC) displays the highest mortality rates, being, therefore, considered a major challenge for the clinic. The use of molecules as tumor markers has helped clinicians in the diagnosis, prognosis and even in treatment of TNBC, being essential in reducing its high mortality rate. However, a small group of tumor markers is validated in clinical practice, stimulating the search for new targets, and their functional characterization, as a way to understand the biology of this disease. Thus, the aim of this work is to functionally characterize the CD14 protein-coding gene and the non-protein-coding LINC01133 gene in human TNBC cell lines, in order to probe into the role of these molecules in tumor progression. In the first part of this work, the expression of CD14 was analyzed in a panel of cell lines that represent the different subtypes of breast tumors. High expression levels of CD14 were observed in the non-tumorigenic MCF10A and MCF12A lineages and low levels in the triple negative Hs578T lineage. Based on these results, CD14 was overexpressed in the Hs578T lineage. Functional characterization assays showed that CD14 overexpression reduced the migratory and invasive capacity of cells, an effect that was hypothetically related to increased E-cadherin expression. However, increased in the tumorigenic potential was observed, leading us to suggest its involvement in a possible mechanism used by cells to compensate for the significant reduction in the migratory and invasive potential. The results obtained indicate that CD14 expression basal level observed in the Hs578T lineage may be important to contribute to the primary development of tumor, thus acting as an oncogene. In the second part of this work, the expression of 10 long non-coding RNAs (lncRNAs) was analyzed against the same lineage panel described above. Among these, the LINC01133 lncRNA exhibited low expression levels in the non-tumorigenic MCF10A and MCF12A lineages and high levels in the triple negative Hs578T lineage, being, then, chosen as a target for this study. Based on these results, we decided toinducibly overexpress LINC01133 in the MCF10A lineage and knockout this gene, via the CRISPR/Cas9 system, in the Hs578T lineage. Functional characterization assays showed that overexpression of LINC01133 in the MCF10A lineage reduced cell proliferation and inhibited anchorage-dependent colony growth, but, on the other hand, increased anchorage-independent colony growth and the migratory and invasive capacity of these cells. However, we suggest that this is not sufficient to render these cells tumorigenic and metastatic. On the other hand, the knockout of LINC01133 in the triple negative Hs578T lineage considerably increased all the analyzed malignancy parameters. Based on the results obtained, we suggest that the high expression level of LINC01133 in the Hs578T lineage is important for down-regulation of processes related to tumor progression, acting as a tumor suppressor. The data obtained in our study contribute to the enrichment of information related to TNBC Biology, thus assisting in the development of potential clinical and therapeutic protocols using these biomarkers

INVASIVE TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER WITH BASAL AND NON-BASAL-LIKE IMMUNOPHENOTYPES: PROGNOSTIC IMPLICATIONS / Carcinoma invasivo de mama triplo negativo com imunofenótipo basal e não basal: implicações prognósticas Darley de Lima Ferreira Filho1*, Nancy Cristina Ferraz de Lucena Ferreira1, Maria do Carmo Abreu

Objectives: The objective of the study was to compare the postoperative staging and clinical development outcomes in a period of three years with the histopathological and immunohistochemical characteristics considered prognostic and/or predictive factors in patients being treated for triple negative type of breast cancer in the Barão Lucena Hospital, Recife, Pernambuco. Method: The study was conducted with 125 female patients suffering from triple negative breast cancer who underwent surgical treatment in the mastology service of Barão Lucena Hospital from 2009 to 2012. The clinical and pathological features of the tumors were studied and correlated with basal and non-basal subtypes. A descriptive data analysis was carried out using tables and/or graphs for qualitative variables. Association analysis was performed using χ2 test for independence. In tables that showed expected frequency lower than 5, in more than 20% of cells, we used the Fisher's exact test. In addition, the odds ratio (OR) and the confidence interval (CI) for OR were calculated. In the entire analysis, a 5% significance level was considered. Results: M ean a ge w as 4 9 y ears; r egarding r ace, b lack w as p resent i n 8 3 ( 66.4%). The most common histological type was ductal, in 111 (88.8%). The pathological stage I/II was the most common, in 87 (69.6%) patients. A total of 71 patients (56.8%) showed no axillary metastasis. Regarding the type of surgery, the conservative one was performed in 57 (45.6%), including sectorectomy and oncoplastic surgery. The recurrence was present in 30 patients, basal in 16 (53.3%) patients and 14 (46.7%) in the non-basal, and bone metastasis was the most frequent. Conclusion: In this triple-negative tumor sample, the most important facts related to survival were: being aged less than 40 years, histological type, cytokeratin CK5/6 and higher significance level of the factors EGFR and KI-67.

Objetivos: O objetivo do estudo foi correlacionar o estadiamento pós-cirúrgico e a evolução clínica em um período de três anos com as características histopatológicas e imunoistoquímicas consideradas fatores prognósticos e/ou preditivos nas pacientes em tratamento de câncer de mama do tipo triplo negativo do Hospital Barão de Lucena, Recife, Pernambuco. Método: O estudo foi feito com 125 pacientes do sexo feminino portadoras de câncer de mama triplo negativo e que foram submetidas a tratamento cirúrgico no serviço de mastologia do Hospital Barão de Lucena no período de 2009 a 2012. Nessas pacientes foram estudadas as características clínicas e patológicas dos tumores, as quais foram correlacionadas com os subtipos basal e não basal. A análise descritiva dos dados foi feita através de tabelas e/ou gráficos para variáveis qualitativas. Para análise de associação, foi utilizado o teste do χ2 para independência. Nas tabelas que apresentaram frequência esperada menor que 5, em mais de 20% das caselas, foi utilizado o teste exato de Fisher. Além disso, foi calculada a razão de chance (OR) e o intervalo de confiança (IC) para OR. Em toda a análise foi considerado nível de significância de 5%. Resultados: A média de idade foi de 49 anos; com relação à raça, tivemos a cor negra em 83 (66,4%) delas. O tipo histológico mais comum foi o ductal, em 111 (88,8%) pacientes. O estágio patológico I/II foi o mais comum, em 87 (69,6%) delas. Um total de 71 (56,8%) pacientes não demonstrou comprometimento axilar. Com relação ao tipo de cirurgia, a conservadora foi utilizada em 57 (45,6%) pacientes, incluindo setorectomia e técnicas de oncoplastia. A recorrência esteve presente em 30 pacientes, sendo basal em 16 (53,3%) e não basal 14 (46,7%) delas, nas quais a metástase óssea foi a mais frequente. Conclusão: Nessa amostra de tumores triplo negativo, os fatos mais importantes associados à sobrevida foram a idade abaixo de 40 anos, o tipo histológico, a citoqueratina CK5/6 e o grau de significância maior dos fatores EGFR e KI-67.

ANDROGEN RECEPTOR EXPRESSION IN TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER AND ITS RELATIONSHIP TO PROGNOSTIC FACTORS / Expressão de receptor de androgênio em câncer de mama triplo negativo e sua relação com fatores prognósticos

Objective: Triple negative breast cancer (TNBC) is a subset of tumors with an aggressive intrinsic biology, resulting in poor prognosis. Androgen receptor (AR) is currently one of the most studied biomarkers in TNBC, playing a role in the genesis and development of breast cancer. Methods: In this cross-sectional study, we retrospectively reviewed the medical records of all patients with TNBC who received care from 2012 to 2014 at a single health center in southern Brazil. Histological material from breast tumors was analyzed by immunohistochemistry for AR expression and related to age, histological grade, tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), and Ki-67. Results: Of 34 TNBC cases identified, 23 (67.6%) were AR negative and 11 (32.4%) were AR positive. The average age of the patients was 51.9 years (range: 30­82 years). Among positive cases, AR was weakly expressed in 6 and strongly expressed in 5 cases. Most patients (n=28; 82.0%) had poorly differentiated tumors. Mean Ki-67 expression was 65.0% in AR-negative and 43.6% in AR-positive cases (p<0.05). There was a significant association between age and AR expression (p<0.005), which was associated with mean age 70.8 years in the strongly AR-positive group and 42.3 years in the weakly AR-positive group. The mean percentage of TILs was 38.6% in AR-positive and 39.1% in AR-negative cases (p=0.391). Conclusion: There was no significant association between AR expression and histological grade or TILs. AR positivity in TNBC was associated with older age and tumors with lower Ki-67 expression, indicating two subgroups with distinct phenotypes in patients with TNBC.

Objetivo: O câncer de mama negativo triplo (triple negative breast cancer ­ TNBC) é um subtipo de tumores com biologia intrínseca agressiva, resultando em pior prognóstico. O receptor de andrógeno (androgen receptor ­ AR) é atualmente um dos biomarcadores mais estudados em TNBC, desempenhando papel na gênese e no desenvolvimento do câncer de mama. Métodos: Neste estudo transversal, revisamos retrospectivamente os registros médicos de todos os pacientes com TNBC que receberam atendimento de 2012 a 2014 em um único centro no sul do Brasil. O material histológico dos tumores de mama foi analisado por imuno-histoquímica para a expressão de AR e relacionado a idade, grau histológico, linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) e Ki-67. Resultados: Dos 34 casos identificados de TNBC, 23 (67,6%) eram AR negativos e 11 (32,4%), AR positivos. A idade média foi de 51,9 anos (30­82 anos). Entre os casos positivos, AR foi fracamente expresso em 6 e fortemente expresso em 5 casos. A maioria dos pacientes (n=28, 82,0%) apresentou tumores pouco diferenciados. A expressão média de Ki-67 foi de 65,0% em AR-negativo e 43,6% em AR-positivo (p<0,05). Houve associação significativa entre a idade e a expressão de AR (p<0,005), associada à idade média de 70,8 anos no grupo com AR fortemente positivo e de 42,3 anos no grupo com AR fracamente positivo. A porcentagem média de TILs foi de 38,6% em AR-positivo e de 39,1% em AR-negativo (p=0,391). Não houve associação significativa entre expressão AR e grau histológico ou TILs. Conclusão: A positividade de AR em TNBC foi associada com idade mais avançada e tumores com menor expressão de Ki-67, indicando dois subgrupos com fenótipos distintos em pacientes com TNBC.

The Apocrine Profile of Triple-negative Breast Carcinomas in Patients Aged 45 Years or Younger: favorable but rare features / Perfil apócrino em carcinomas mamários triplonegativos de pacientes até 45 anos: característica favorável, ainda que rara

Abstract Objective Triple-negative breast carcinomas (TNBCs) represent a heterogeneous group of neoplasias, even though they generally exhibit a clinically more aggressive phenotype, and are more prevalent in young women. To date, targeted therapies for this group of tumors have not been defined. The aim of this study was to evaluate the frequency of the apocrine subtype in TBNCs from premenopausal patients as defined by the immunohistochemical expression of the androgen receptor (AR) and its association with: histological type; tumor grade; proliferative activity; epidermal growth factor receptor (EGFR) expression; and a basal-like phenotype. Methods A total of 118 tumor samples from patients aged 45 years or younger were selected and reviewed according to histological type and grade. Ki-67 expression was also evaluated. Immunohistochemical expression of the AR, basal cytokeratin ⅚, and EGFR expression were analyzed in tissue microarrays. The apocrine subset was defined by AR-positive expression. The basal-like phenotype was characterized by cytokeratin ⅚ and/or EGFR expression. Results An apocrine profile was identified in 6/118 (5.1%) cases. This subset of cases also exhibited a lower rate of Ki-67 expression (17.5% versus 70.0%, p= 0.02), and a trend toward a lower histological grade (66.7% versus 27.9%, p= 0.06). Conclusions The apocrine subtype of TNBCs is rare among premenopausal women, and it tends to present as carcinomas of lower grade and lower proliferative activity, suggesting a less aggressive biological phenotype.

Resumo Objetivo Carcinomas mamários triplo-negativos representam um grupo heterogêneo de neoplasias, embora geralmente exibam fenótipo clinicamente mais agressivo e sejam mais prevalentes em mulheres jovens. Até o presente, terapias-alvo para esses grupos não foram definidas. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência do subtipo apócrino em carcinomas mamários triplo-negativos de mulheres na pré-menopausa, definido pela expressão imuno-histoquímica do receptor de androgênio, e sua associação com tipo histológico, grau histológico, atividade proliferativa, expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e o fenótipo basal-símile. Métodos Foram selecionadas 118 amostras de tecido tumoral de pacientes com até 45 anos de idade. As amostras foram revisadas quanto a tipo e grau histológicos e expressão do Ki-67. A expressão imuno-histoquímica de receptor de androgênio, citoqueratina basal ⅚, e do EGFR foram analisadas em amostras de microarranjos de tecido. O subtipo apócrino foi definido pela positividade do receptor de androgênio. O fenótipo basal-símile foi caracterizado pela expressão da citoqueratina ⅚ e/ou do EGFR. Resultados O perfil apócrino foi identificado em 6/118 (5,1%) casos. Este subgrupo apresentou menor fração de expressão do Ki-67 (17,5% versus 70,0%, p= 0,02) e uma tendência a menor grau histológico (66,7% versus 27,9%, p= 0,06). Conclusões O subtipo apócrino dos carcinomas mamários triplo-negativos é raro em mulheres na pré-menopausa, e tende a se apresentar como carcinomas de menor grau e menor atividade proliferativa, sugerindo fenótipo biológico menos agressivo.

Impacto do fenótipo triplo-negativo no prognóstico de pacientes com câncer de mama de uma unidade de referência no Brasil central / Impact of triple negative phenotype on prognosis of breast cancer patients from a reference cancer unity in the central of Brazil

Introdução: o câncer de mama triplo-negativo inclui os tumores que não expressam receptores de estrógenos, receptores de progesterona e HER2. O subtipo triplo-negativo apresenta características mais agressivas, como aparecimento em idade mais precoce, estágio avançado ao diagnóstico, alta graduação histológica e nuclear, alto índice mitótico, maior frequência de metástases regionais e à distância, além de menor sobrevida. Objetivo: comparar os aspectos clínicos e patológicos de 345 pacientes com carcinomas mamários tratadas em um hospital de referência na região Centro-oeste do Brasil, a fim de avaliar o impacto do fenótipo triplo-negativo no prognóstico das pacientes. Metodologia: as pacientes foram selecionadas no Laboratório de Anatomia Patológica da instituição e os dados clínicos e patológicos coletados a partir dos respectivos prontuários. A análise estatística empregou análise univariada e análise de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier e Log-rank. Resultados: os fatores prognósticos clássicos foram comprovados para o grupo, incluindo comprometimento de linfonodos regionais (p<0,001), metástase à distância (p<0,001) e tamanho do tumor (p<0,001). Quando os tumores, distribuídos em dois grupos (TN e NTN), foram comparados, diferenças estatisticamente significativas foram observadas com relação ao grau nuclear (p<0,0001) e à sobrevida em cinco anos (p<0,0001), que variou de 70,3% para as pacientes NTN a 47,1% para as pacientes TN. Conclusão: nossos resultados confirmaram o perfil mais agressivo dos tumores TN que, independentemente dos fatores prognósticos clássicos dos carcinomas de mama, cursam com maior agressividade e maior taxa de mortalidade, requerendo assim maior atenção assistencial.

Introduction: Triple-negative breast cancers are tumors that don't express estrogen receptors, progesterone receptors and HER2. The triple-negative phenotype exhibits more aggressive characteristics, including early onset, high stage on diagnosis, elevated nuclear grade, high mytotic index, agressive patterns of regional and distant metastasis, besides poor prognosis. Objective: To compare the clinical and pathological aspects of a group with 345 breast cancer patients treated in a referral hospital in the center of Brazil, in order to compare the impact of triple-negative phenotype on the patient prognosis. Methods: Patients were selected in the Pathology Laboratory of the institution. Clinical and pathological data were collected from the respective clinical files. Statistical methods comprised univariate analysis and survival curves were generated by using Kaplan-Meier and Log-rank tests. Results: Classic prognostic factors were confirmed for the whole group, including regional lymph nodes metastasis (p<0.001), distant metastasis (p<0.001) and tumor size (p<0.001). By comparing the two groups of breast tumors (TN and NTN), significant statistical differences were observed concerning nuclear grade (p<0.0001) and five year survival (p<0.0001), which varied from 70.3% for NTN patients to 47.1% for TN patients. Conclusion: Our results reinforce the aggressive profile of triple-negative breast cancer that, despite of the classic prognostic factors described for breast cancer, evolves with higher aggressiveness and elevated mortality rates, requiring special attention

Câncer de mama triplo-negativo: aspectos clínicos, laboratoriais e terapêuticos: [revisão] / Triple negative breast cancer: clinical, loboratorial and therapeutic aspects: [review]

O câncer de mama é a neoplasia maligna mais comum entre as mulheres, e sua incidência vem aumentando de maneira consistente nas últimas décadas. A melhor compreensão anatomopatológica e molecular do câncer de mama vem permitindo observar que os diferentes subtipos desta doença apresentam características clínicas e prognósticas diferentes, além de perfil de resposta aos tratamentos diferenciados para cada subtipo. Neste artigo, serão revistos os principais aspectos clínicos, laboratoriais e terapêuticos do subgrupo de câncer de mama triplo-negativo; subgrupo de doença definido, do ponto de vista imunoistoquímico, pela ausência de receptores hormonais ou de HER-2. Esse tipo de câncer de mama representa novo desafio para os profissionais envolvidos no tratamento multidisciplinar dessa neoplasia, e vem tornando-se foco de inúmeros estudos destinados a permitir sua melhor compreensão e ao desenho de estratégias terapêuticas mais eficientes.

Breast cancer is the most common cancer among women; the incidence of such disease is increasing through the last decades. Recently, several advances regarding the understanding of the pathology and molecular biology of breast cancer directed us to a new understanding of the disease pathologic mechanisms, leading to a molecular classification and, consequently, a novel way to treat the patients. In this review we will focus on the main clinical, laboratorial and therapeutical aspects of the triple negative breast cancer, as well as on the differences and similarities among triple negative, basal-like and BRCA1 linked breast cancers.